中國南方漢族人色氨酸羥化酶-2基因G1463A多態性與單相抑鬱症不存在相關

抑鬱症是一種常見的、可導致精神殘疾和自殺死亡的精神疾病。其終生患病率約為5至17%[1]。雖然抑鬱症的發病與環境因素有關，但遺傳因素佔有較大的比重，其遺傳度約為40至70%^[1]。家系研究、雙生子和寄養子研究均顯示遺傳因素與抑鬱症有關[2]。目前，與抑鬱症發病相關的具體基因或相關DNA序列還未得到確認。因此，尋找與抑鬱症相關的致病基因仍然是目前抑鬱症病因學研究的熱點之一。

精神藥理學和神經行為研究結果表明，中樞5- 羥色胺（5-HT）功能異常與抑鬱症的發病相關^{[ 2]}。 5-HT功能活動降低與抑鬱症患者的抑鬱心境、食欲減退、失眠、晝夜節律紊亂、內分泌功能紊亂、性功能障礙、焦慮不安、活動減少等密切相關^[3]。而且，中樞5-HT系統是目前大多數抗抑鬱藥如三環類、選擇性 5-HT再攝取抑制劑（SSRIs）、單胺氧化酶抑制劑等的作用靶點^[4]。中樞5-HT主要在腦幹背側縫際核中合成^[5]。其在體內的生物過程包括合成、儲藏、轉運、釋放、作用於靶受體、攝取、代謝。調節和執行這些生物過程的蛋白質和相應的基因有：色氨酸羥化酶-1和- 2（TPH1及TPH2）、2型囊泡單胺轉運體（VMAT2）、5-HT轉運體（5-HTT）、單胺氧化酶-A（MAOA）和5-HT系列受體包括5-HT1A、2A、2C、3、4、5、6、7等[6]。這些5-HT相關基因由此成為抑鬱症病因學研究的候選基因。

色氨酸羥化酶（TPH）是5-HT生物合成的限速酶，它包括色氨酸羥化酶-1（TPH1）和色氨酸羥化酶-2（TPH2）。TPH1主要分布在外週組織如心臟、肺、十二指腸、肝臟和腎上腺中，也在部分腦區表達，主要控制外週5-HT合成。TPH2則為神經元特異性，只在腦區5-HT神經元中表達。TPH1和TPH2在部分腦區（如海馬、額葉、丘腦、下丘腦、杏仁核）中的表達量幾乎相等，但TPH 2 在腦幹中佔絕對優勢，而腦幹是5-HT神經元的產生地^[7]。近年來，有關 TPH2基因多態性與抑鬱症的遺傳關聯研究結果很不一致^[8-16]。其中在2005年，美國Duke大學醫學中心的 Zhang及其研究小組[4]發現，人類TPH2基因編碼區存在一個G1463A的功能多態，導致第441位精氨酸被組氨酸替代（R441H），從而引起TPH2喪失約80%的功能，致使5-HT生成明顯減少。Zhang等^[4]還分析了 TPH2 G1463A多態性與情感障礙的關係，結果顯示， 87例單相抑鬱病人中有 9例攜帶 1463A突變等位基因，而219例對照組中僅3例攜帶該突變等位基因。這提示R441H的變異可能是單相抑鬱的一個重要危險因子。為了在中國漢族人群中驗證這結果，本研究採用關聯分析的方法，研究中國南方漢族人群中TPH2 G1463A多態性與單相抑鬱症的相關性。

對象與方法

研究對象

所有研究對象均為中國南方廣東省的漢族人，入組前均簽訂知情同意書。

病例組

病例組123例，均來自廣東省人民醫院廣東省精神衛生研究所門診和住院部。患者中，男42例，女81例，年齡介乎16至65歲，平均年齡38歲，標準差14歲。抑鬱症的診斷由課題組中2名精神科副主任醫師或以上職稱的人員採用《中國精神障礙分類與診斷標準（第三版）》(CCMD-3)中抑鬱發作與美國《精神障礙診斷與統計手冊（第四版）》（DSM-IV）中重性抑鬱發作的診斷標準共同確診為單相抑鬱症。漢密爾頓抑鬱量表24項版（HAMD-24）評分總分均為20分以上。排除患有神經系統疾病、其他嚴重的軀體疾病、繼發性抑鬱、雙相障礙和其他功能性精神障礙者。

對照組

對照組122例，來自廣東省人民醫院體檢中心的健康體檢者及醫院的工作人員、實習學生。122例中，男 55例，女67例，年齡介乎18至65歲，平均年齡37歲，標準差14歲。排除嚴重的軀體疾病、遺傳性疾病和精神疾病，相互間無血緣關係。經統計檢驗，病例組和對照組在性別分布和年齡上無顯著性差異（P>0.05）。

標本採集及基因組DNA提取

採集抑鬱症患者及正常健康對照外週靜脈血各5 ml，檸檬酸鈉抗凝，用柱式血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA（操作按試劑盒說明書）。

TPH2 G1463A基因型分析

採用擴增阻滯突變系統-PCR（ARMS-PCR）法^[4]分析 TPH2 G1463A基因型。PCR反應引物由2條正反向的陽性對照側翼引物及1條G或A等位基因特異性引物組成。根據人TPH2基因的編碼DNA序列，分別設計正向對照引物F為：5'-ATG TGT GAA AGC CTT TGA CCC AAA GAC A-3'；反向對照引物R為：5'-TGC GTT ATA TGA CAT TGA CTG AAC TGC T-3'；G等位基因特異性引物P 為：5'-TAG GGA TTG AAG TAT ACT GAG AAG GCA C；A等位基因特異性引物P 為：5'-TAG GGA TTG AAG TAT ACT GAG AAG GCA T。對每個樣品進行2次 PCR，分別檢測可能的G/A等位基因，用於檢測G等位基因的引物是F+R+P_G，檢測等位基因的引物是F+R+P 。PCR反應體積為25 ml，12.5 µl GoTaq Green Master Mix，2×（reaction buffer，pH > 8.5；400 µM dNTP；3 Mmol MgCl2）；DNA模板2 µl （³100 µg）；引物各1 µl（10 µmol/l）；ddH2O 8.5 µl。PCR反應條件：94˚C預變性5分鐘（94˚C 30秒、63˚C 30秒、72˚C 30秒）×40循環，最後72˚C延伸5分鐘。取PCR產物 5 µl，2%瓊脂糖凝膠電泳分離產物，EB染色後觀察結果，根據電泳帶型確定TPH2 G1463A基因型：即根據所用檢測G或A等位基因的引物組合，PCR產物只有 492 bp條帶為陰性，有492 bp和294 bp兩個條帶為陽性。部分PCR產物牽涉DNA序列測定。

PCR產物的DNA序列測定

為驗證採用ARMS-PCR法進行TPH2 G1463A基因分型結果的準確性，對部分（8例）樣品DNA的PCR產物進行測序鑑定。由上海英駿生物技術有限公司廣州分公司（Shanghai Invitrogen Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou Office）代理開展。具體步驟如下：（1） PCR未純化產物割膠回收；（2）鑑定樣品的條帶亮弱，決定做反應時所加模板的量；（3）以水、引物、模板的順序將反應體系加到96孔板，上PCR 96˚C儀變性；（4）冷卻後加 1 µlBDT，再上PCR儀，擴增25個循環；（5）冷卻後加EDTA 放置5分鐘左右；（6）加 15 µl無水乙醇，4˚C下離心30分鐘；（7）倒離心後加50 µl 70%冰乙醇，4˚C下離心15分鐘（重複一次）；（8）倒離心後晾乾；（9）加10 µl去離子甲酰氨，上 PCR儀變性；（10）冷卻後，上3730測序儀收集信號。

統計學分析

採用SPSS13.0進行數據管理，計算基因型頻率、等位基因頻率。兩組間基因型頻率和等位基因頻率分布差異採用c²檢驗，理論值少於5時採用Fisher確切概率分析。

結果

瓊脂糖凝膠電泳和DNA測序結果顯示（圖），在所有研究對象中均未檢測到TPH2 1463A突變等位基因， 123例單相抑鬱和122例健康對照均為是1463G的純合子。按照Zhang等^[4]的報道，單相抑鬱患者中1463A等位基因的頻率為5.17%，按照這個頻率，在單相抑鬱的樣本中應該觀察到6例攜帶G1463A的患者。但是，無論是病例組還是對照組，一例1463A等位基因的個體也沒有觀察到。

討論

Zhang等^[4]於2005年首先報導了人類TPH2基因編碼區存在一個G1463A的功能多態性，但在隨後的研究中，許多研究組並沒有重複出Zhang等人的發現。 Garriock等^[13]通過對與Zhang等的研究在種族和性別分布方面相似的182例單相抑鬱病人（其中83例對治療抵抗，8例對治療抵抗的雙相情感障礙病人，和186例健康對照）的TPH2 G1463A序列進行分析，結果在 TPH2 G1463A位點沒有發現一例攜帶1463A突變等位基因。他們還首次對TPH2基因第11外含子的其他兩個單核苷酸缺失變異（C1487G和T1578G）進行了研究，結果對C1487G和T1578G的序列分析也沒有發現單核苷酸的變異。Van Den Bogaert等^[14]對兩個獨立的病例–對照樣本進行了TPH2 G1463A基因分型。一個樣本由135例單相抑鬱病人（平均年齡57歲）和182例雙相情感障礙病人（平均年齡56歲）組成病例組， 364例性別、年齡、種族相匹配的個體作為對照組。另一樣本由182例單相抑鬱病人（平均年齡47歲）， 182例雙相情感障礙病人（平均年齡 56歲）組成病例組，364例性別、年齡、種族相匹配的個體構成對照組。結果在兩個研究樣本中沒有觀察到一例攜帶 1463A等位基因的個體。此外，他們還分析了Zhang等觀察到突變等位基因而他們則沒有觀察到的原因： Zhang等^[4]的研究樣本選擇的病人年齡偏高（60歲以上），並且7例攜帶1463A的抑鬱症患者對SSRI治療無效。Glatt等^[15]對來自具有廣泛種族代表性的1023例單相抑鬱症患者進行了TPH2 G1463A的基因型分析，也沒有發現一例攜帶1463A等位基因的個體。Zhou等^[16]對779例無關個體（403例單相抑鬱，平均年齡60歲以上）和1740例重性抑鬱患者進行了TPH2 G1463A基因分型，結果仍然沒有發現一例攜帶1463A等位基因的個體。他們推測TPH2 1463A等位基因是非常罕見的突變基因，可能和重性抑鬱或其他行為沒有相關性。如果和其他的行為有相關性，對比他們自己所研究的老年群體，認為441H等位基因可能和抑鬱的遲發有關。另外，Delorme等^[12]使用3種不同的方法：ARMS- PCR、限制性片段長度多態性（RFLP）和直接測序對 1071例精神障礙患者（265例單相抑鬱、297例重性抑鬱、84例雙相障礙、201例強迫衝動障礙、224例孤獨症患者）和246例健康志願者進行了TPH2 G1463A基因分型，結果亦全部是1463G純合子。

本研究在中國南方漢族人群中亦沒有發現TPH2 1463 A等位基因，和上述多位作者的研究結果相似，但與Zhang^[4]最早的報道結果不一致。究其原因有：（ 1 ）抑鬱症本身可能存在著地域和種族的差異。（2）和Zhang的研究樣本（單相抑鬱病人年齡60歲或以上）相比，本研究的病人平均年齡為（38±14）歲，發病年齡偏小。因為發病年齡不同，可能遺傳背景也不同。（3）TPH2 1463A等位基因可能是一種罕見的突變基因，由於本研究的樣本量不是很大，從而影響了TPH2 1463A等位基因的檢出。（4）1463A等位基因可能主要見於SSRI（5-羥色胺再攝取抑制劑）治療反應差的抑鬱症個體，Zhang的研究發現，9例攜帶A突變等位基因者中，有7例對SSRI治療無效，另 2例則需要很高劑量。本研究樣本中未見明顯SSRI治療無效者，可能導致未測出該等位基因。（5）由於本研究和其他研究均未檢出1463A等位基因，該基因多態性和抑鬱症可能沒有關係。總之，本研究結果不支持在中國南方漢族人群中TPH2 G1463A基因多態性和抑鬱症存在相關性。

本研究的不足之處在於其樣本量還不是足夠大。另外，本研究結果雖然未發現在中國南方漢族人群中 TPH2 G1463A基因多態性和抑鬱症存在遺傳關聯，但由於TPH2基因存在多個不同多態位點^[8-11]，因此本文結果並不能排除TPH2基因其他多態位點與抑鬱症的遺傳相關性。為了充分揭示TPH2基因多態性與抑鬱症的關係，在今後進一步的研究中，除應該提高研究樣本量外，還應該分析TPH2基因不同多態性間的交互作用以及環境因素對基因多態性表達的影響。

致謝

本文的實驗室工作主要在廣東省人民醫院醫學研究中心完成，期間得到了單志新博士和譚紅紅技師的指導和大力支持。

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